PCR实验室
Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其**度高达纳米级别，**检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人*适合使用哪类抗病毒**、判断**疗效如何、给临床**提供了可靠的检验依据。
一、开展pcr实验室应具备的条件：
1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室；
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求；
荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
3、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书；
4、必须通过国家临床检验中心的验收和认证；
PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生**，确保实验室长期稳定运行。
5、必须在无菌无尘环境下进行操作。
二、pcr实验室的功能：
能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞**来打破**耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药，病毒复制模板难以**，人体**耐受状态不易打破等医学难题，能迅速消除临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗体的血清转换速度，杀灭血液及肝细胞内的病毒，为防止再感染提供了长期保护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。
三、怎样建立pcr实验室
1、建立样品准备区
这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：
（1）PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。
（2） 用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。
（3） DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶**。
（4） 组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。
（5）大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。
（6）管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。
（7）任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。
3、建立前PCR区。
该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR实验室试剂的操作。
（1）所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。
（2）所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压**。
（3）在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。
（4）所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
（5） 新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
（6） 所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性**的瓶子和管子。
（7） 样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物。
（1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。
（2）如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够**的PCR成分。
（3）作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。
（4）阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。
（5）当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用*少数量的核酸。
（6）由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。
6、控制污染的方法。
已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG，这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。
7、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动
四、 PCR实验室平面布局
PCR扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。
各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。
五、实验室空调通风系统设计及压力控制
PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。
1、试剂贮存和准备区
该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。
2、标本制备区
该区域主要进行的操作为样本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。
本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。
3、扩增反应混合物配制和扩增区
该区域主要进行的操作为DNA扩增。此外，已制备的DNA模板 (来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。
本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。
4、扩增产物分析区
该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。
本区是*主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。
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